[M467T]rBAT/b0+AT: una paraulota o la causa de les pedres als ronyons?

Els aminoàcids (AA), els components de les proteïnes, són essencials per a la vida. Durant la digestió, les proteïnes contingudes en els aliments són degradades per diversos enzims. Com a resultat, s’obtenen pèptids i AA, els quals són absorbits a l’intestí prim i traslladats a tots els teixits del cos a través del corrent sanguini. Quan la sang és filtrada als ronyons, els AA són reabsorbits als vasos sanguinis perquè no formen part de les substàncies de rebuig destinades a ser excretades en forma d’orina. Totes aquestes transferències que pateixen els AA entre òrgans, cèl·lules i estructures cel·lulars són realitzades pels transportadors d’AA.

Per tant, els transportadors d’AA són proteïnes de membrana responsables de la incorporació d’AA a la cèl·lula i de regular-ne el seu balanç entre l’exterior i l’interior cel·lular. Ara bé, quan no funcionen de manera convencional, causen patologies metabòliques com la cistinúria, una malaltia hereditària que provoca l’acumulació de pedres als ronyons. La majoria dels pacients presenten la mutació M467T de rBAT/bº+AT. 

rBAT/bº+AT, malgrat tenir un nom antipàtic, és un transportador d’AA que està format per dues subunitats, una pesada (rBAT) i una lleugera (bº+AT). M467T, en canvi, és una mutació que inhabilita l’activitat de rBAT/bº+AT, la qual cosa provoca que els AA no puguin ser reabsorbits al corrent sanguini i s’acumulin en l’orina, formant així el principal símptoma de la cistinúria: les pedres als ronyons. 

Com que normalment els seus pacients presenten més d’una mutació i no sempre en la mateixa subunitat de rBAT/bº+AT, la cistinúria és una malaltia molt difícil de tractar. A més a més, el fet que sigui una malaltia minoritària comporta que no es destinin prou recursos a la seva investigació, de manera que els pacients cistinúrics no només han de suportat el dolor propi de les pedres als ronyons, sinó que, per si no n’hi hagués prou, l’han de suportar, ara per ara, de forma indefinida. Per tot això, aquest Treball de Recerca (TR) es va enfocar a delimitar quin efecte té la mutació M467T en el funcionament del transportador d’AA rBAT/bo+AT. 

Per tal de tractar aquesta qüestió, es va analitzar la biogènesi de [M467T]rBAT/bo+AT (la proteïna rBAT/bº+AT que conté la mutació M467T) en cèl·lules HeLa transfectades durant 48 hores, unes cèl·lules tumorals a les quals se’ls havia introduït (transfectat) el material genètic necessari perquè sintetitzessin prou rBAT/bº+AT i [M467T]rBAT/bº+AT com per dur a terme totes les tècniques que s’expliquen a continuació. Aquest pas previ es va dur a terme mitjançant una transformació bacteriana i una transfecció. I ara sí, un cop fets i exposats aquests dos passos primordials, l’estudi es va desenvolupar en dues parts.

En la primera part, es va comparar l’expressió del transportador sa i el transportador mutat per descartar (o no) que M467T afectés la síntesi de rBAT/bo+AT. D’aquesta manera es va formular la primera hipòtesi del treball: “El transportador rBAT/bº+AT s’expressa en major quantitat que [M467T]rBAT/bº+AT perquè aquest últim és degradat per la cèl·lula en un procés d’autofàgia.” O, en altres paraules, es va raonar que la proteïna mutada ([M467T]rBAT/bº+AT) es sintetitza en menor quantitat que la proteïna sana (rBAT/bº+AT). 

L’experiment efectuat per tractar aquesta hipòtesi va ser el western blot, una tècnica que permet separar totes les proteïnes d’una cèl·lula (a través d’un gel d’electroforesi) i identificar-ne una en concret (l’anomenada proteïna d’interès, que en el nostre cas és rBAT/bº+AT) gràcies als anticossos, unes molècules que només reconeixen una proteïna determinada, s’hi uneixen i la marquen amb fluorescència. En conseqüència, podríem dir que cada anticòs “delata” la presència d’una proteïna (la fa visible amb un color). 

Els resultats obtinguts per a aquesta primera hipòtesi, suggereixen que [M467T]rBAT/bo+AT s’expressa en la mateixa quantitat (o fins i tot més) que rBAT/bo+AT. En conseqüència, la primera hipòtesi del treball va ser falsada i en vam concloure que [M467T]rBAT/bo+AT s’expressa sense cap dificultat aparent, de manera que l’error funcional no resideix en l’expressió del seu gen ni en la seva síntesi.

En la segona part, es va anar més enllà i es va qüestionar com afecta M467T al trasllat de

rBAT/bo+AT fins a la membrana de les cèl·lules, ja que és en aquesta estructura cel·lular on la proteïna exerceix la seva funció. A partir d’aquesta pregunta va néixer la segona i última hipòtesi d’aquest TR: “A diferència del transportador d’aminoàcids rBAT/bo+AT, la seva mutació [M467T]rBAT/bo+AT no es localitza a la membrana plasmàtica.” Per tant, aquest cop es va afirmar que [M467T]rBAT/bº+AT no és capaç d’arribar a la membrana plasmàtica, una hipòtesi que ja havia estat plantejada en estudis anteriors però que, malgrat això, vam trobar pertinent d’abordar-la una altra vegada perquè, en ciència, com més rèpliques d’un fet hi hagi, millor. 

Així doncs, la tècnica emprada en aquesta segona part va ser la immunofluorescència que, en combinació amb el microscopi confocal, va permetre evidenciar la localització subcel·lular de rBAT/bo+AT i [M467T]rBAT/bo+AT respecte a la membrana plasmàtica. La clau de volta de la immunofluorescència també són els anticossos, ja que a través de la fluorescència que emeten es poden besllumar en el microscopi les diferents parts de la cèl·lula i, sobretot, la nostra proteïna d’interès. La manera de detectar si el nostre transportador ha arribat a la membrana és mitjançant la colocalització; la barreja de colors que s’observa quan dues molècules estan al mateix lloc. La colocalització, doncs, és fruit de la superposició de dos colors diferents, uns colors que obtenim gràcies a l’ús d’anticossos.

Pel que fa als resultats extrets d’aquesta última hipòtesi, aquests suggereixen que [M467T]rBAT/bo+AT no és capaç d’arribar a la membrana cel·lular (perquè no es va  observar una colocalització entre la proteïna i la membrana) i confirmen que rBAT/bo+AT és una proteïna que actua a la membrana (ja que en rBAT/bo+AT sí que es va obtenir una barreja de colors). En conseqüència, la segona hipòtesi va ser confirmada.

En conclusió, doncs, aquest estudi indica que les cèl·lules afectades per la mutació M467T sintetitzen correctament el transportador d’aminoàcids rBAT/bº+AT, però que aquest, a causa de la mutació, és incapaç de traslladar-se a la membrana plasmàtica (on, recordem-ho, exerceix la seva funció). De retruc, això provoca que els AA no puguin ser reabsorbits per les cèl·lules renals i que, retornats al corrent sanguini,  s’acumulin en l’orina i que es formin les pedres als ronyons, el principal símptoma de la cistinúria. D’aquesta manera, la totalitat del TR ha aportat més dades a la investigació d’aquesta malaltia minoritària i ha confirmat alguns resultats d’altres estudis previs.

Ara bé, si he pogut fer un treball d’aquestes característiques i disposar d’un laboratori ha estat gràcies al programa Joves i Ciència organitzat per la Fundació Catalunya La Pedrera. Aquesta beca m’ha permès dur a terme, durant dues setmanes, les pràctiques del TR a l’Institut de Recerca Biomèdica (IRB) de Barcelona, un centre on, entre moltíssimes altres coses, he après l’art de la investigació científica. M’ha fascinat com és de rigorosa i complexa la realització d’una recerca professional, ja que calen molts recursos, molt temps, i molta saviesa i vocació. 

Lligat amb això, una altra conclusió que es pot extreure d’aquest TR és que calen més estudis i rèpliques per tal de poder validar qualsevol hipòtesi i/o conclusió de la investigació. Al capdavall, quan es tracta de ciència mai no n’hi ha prou amb un sol experiment per demostrar una hipòtesi; sempre cal repetir-los tants cops com calgui. Per això aquest (i qualsevol altre estudi de les mateixes característiques) hauria d’haver comptat, idealment, amb un mínim de 3 rèpliques i en més d’una línia cel·lular. En el nostre cas, però, això no ha estat possible degut a diverses limitacions (temps, recursos, permisos, etc.); a banda que la intenció d’aquest estudi era dur-hi a terme una primera aproximació a un nivell adequat per a una estudiant de Batxillerat.

Per anar acabant, cal esmentar que una possible continuació d’aquesta recerca hauria d’aprofundir en els mecanismes subjacents a l’error funcional de [M467T]rBAT/bº+AT i en la localització subcel·lular exacta de [M467T]rBAT/bº+AT; perquè, si no arriba a la membrana, a quina part de la cèl·lula es troba?

Finalment, m’agradaria aprofitar l’ocasió per donar les gràcies al meu tutor del TR, en Jordi Dantart, perquè a banda d’haver-me donat suport i aconsellat de la millor manera, també m’ha demostrat que és una persona excel·lent. I, per descomptat, també m’agradaria fer extensiu l’agraïment a la Paola Bartoccioni, la investigadora que m’ha acollit al seu laboratori i ha fet possible absolutament tot. Em sento molt afortunada d’haver comptat amb tots vosaltres; gràcies de tot cor.

Podeu llegir més sobre el Treball de Recerca a IPSI en aquest enllaç…